細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是一種程序性細(xì)胞死亡 (PCD)，其特征包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝聚、膜起泡和核碎裂。它對(duì)于形成和維持健康組織至關(guān)重要，幾乎所有生物體在早期胚胎發(fā)育過程中都依靠細(xì)胞凋亡來清除多余細(xì)胞。它也是維持組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過清除衰老或受損細(xì)胞來平衡細(xì)胞群體的增殖與死亡。

很多人在做凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，*常問的坑就是：“Annexin V 陽性了，但 Caspase-3 沒激活？”“JC-1 紅綠比下降了，是凋亡還是壞死？”“Sub-G1 峰怎么算比例？”今天這篇文章從凋亡原理入手，系統(tǒng)梳理主流檢測方法：Annexin V/PI、JC-1、Caspase-3/7活性、7-AAD、TUNEL、PARP裂解、Sub-G1、Cytochrome c 釋放等。重點(diǎn)講解原理、實(shí)驗(yàn)步驟、數(shù)據(jù)解讀和多參數(shù)組合（流式為主，但也包括 WB、IF、顯微鏡等）。讀完后，你能全面掌握凋亡實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證，避免假陽性/假陰性。

核心提醒：凋亡分階段
早期：磷脂酰絲氨酸（PS）外翻、ΔΨm 下降、Caspase 激活
中期：DNA 片段化、細(xì)胞收縮
晚期：膜破裂、壞死樣特征
凋亡 vs. 壞死 vs. 焦亡：需多標(biāo)志物區(qū)分（Annexin V+ PI- = 早期凋亡；Annexin V+ PI+ = 晚期凋亡/壞死）。

一、細(xì)胞凋亡生物學(xué)基礎(chǔ)

凋亡分兩條主要通路：

• 外源性（死亡受體通路）

Fas/TNF-α 等配體 → 死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC） → Caspase-8 → Caspase-3/7 執(zhí)行。

• 內(nèi)源性（線粒體通路）

應(yīng)激 → Bcl-2 家族調(diào)控 → 線粒體外膜通透（MOMP） → Cytochrome c 釋放 → Apaf-1/Caspase-9 → Caspase-3/7。

關(guān)鍵事件：PS 外翻、ΔΨm 下降、Caspase 級(jí)聯(lián)激活、DNA 斷裂（180-200 bp 多聚體）、細(xì)胞收縮、凋亡小體形成。

二、主流檢測方法原理與優(yōu)缺點(diǎn)

1. Annexin V/PI 雙染（流式金標(biāo)準(zhǔn)）

原理：Annexin V 結(jié)合外翻的 PS（Ca2? 依賴），F(xiàn)ITC/APC 標(biāo)記；PI 進(jìn)入膜破裂細(xì)胞。早期凋亡：Annexin V+ PI-；晚期：Annexin V+ PI+；壞死：Annexin V- PI+。

優(yōu)點(diǎn)：活細(xì)胞兼容、早期檢測；缺點(diǎn)：需 Ca2? 緩沖液，背景需對(duì)照。

2. JC-1 檢測線粒體膜電位下降

原理：JC-1 在高 ΔΨm 聚合紅光，低 ΔΨm 單體綠光。凋亡早期 ΔΨm 崩解 → 紅/綠比下降。

優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)源通路早期標(biāo)志；缺點(diǎn)：非特異（其他損傷也可降 ΔΨm），需 CCCP 陽性對(duì)照。

3. Caspase-3/7 活性檢測

AMC）或抗體檢測激活 Caspase-3/7。流式用熒光偶聯(lián)底物或抗活性 Caspase-3 抗體。

優(yōu)點(diǎn)：執(zhí)行階段特異；缺點(diǎn)：需裂解或固定，活細(xì)胞探針（如 CellEvent）更好。

4. 7-AAD 或 PI 單染（晚期凋亡/壞死）

7-AAD 類似 PI，但更特異進(jìn)入膜破裂細(xì)胞。常與 Annexin V 組合，區(qū)分晚期凋亡（Annexin V+ 7-AAD+）與壞死。

5. TUNEL 檢測（DNA 斷裂）

原理：TdT 酶在 DNA 3'-OH 末端標(biāo)記熒光 dUTP。標(biāo)記斷裂 DNA 末端。

優(yōu)點(diǎn)：特異 DNA 片段化；缺點(diǎn)：晚期標(biāo)志，固定后操作。

6. PARP 裂解（WB）

原理：Caspase-3 切割 PARP（116 kDa → 89 kDa 片段）。WB 檢測裂解片段比例。

優(yōu)點(diǎn)：下游執(zhí)行證據(jù)；缺點(diǎn)：群體平均，無法區(qū)分亞群。

7. Sub-G1 峰（PI 染色中的凋亡碎片）

原理：凋亡細(xì)胞 DNA 寡核小體間斷裂 → 小片段泄漏 → PI 熒光 <2N（Sub-G1 峰）。

優(yōu)點(diǎn)：簡單；缺點(diǎn)：非特異（壞死也可），需結(jié)合 Annexin V 驗(yàn)證。

8. Cytochrome c 釋放（IF / WB）

胞質(zhì) → IF 胞質(zhì)彌散（非點(diǎn)狀線粒體），或分離線粒體/胞質(zhì)組分 WB。

三、典型實(shí)驗(yàn)操作流程

方案1：Annexin V/PI 流式雙染

1. 細(xì)胞處理后，溫和消化（胰酶-EDTA 短時(shí)間）或直接收集懸浮細(xì)胞，4°C PBS 洗 2 次。
2. 用 1× Annexin V Binding Buffer 重懸至 1×10? cells/mL。
3. 加 FITC-Annexin V（5 μL/100 μL 細(xì)胞懸液）+ PI（或 7-AAD，1–5 μg/mL），室溫避光孵育 15–20 min。
4. 補(bǔ)加 400 μL Binding Buffer，1 h 內(nèi)上機(jī)（FL1: Annexin V ~530 nm；FL3: PI/7-AAD ~650 nm）。
5. 門控：FSC/SSC 排除碎片和雙聯(lián)體；設(shè)單染對(duì)照補(bǔ)償串色。
6. 陽性對(duì)照：H?O? 或 staurosporine 處理；陰性對(duì)照：不加 Annexin V 或無 Ca2? 緩沖液。

方案2：JC-1 染色（線粒體膜電位檢測）

1. 細(xì)胞重懸于預(yù)熱培養(yǎng)基或 PBS，濃度 1×10? cells/mL。
2. 加 JC-1 工作液（2–5 μg/mL 或 10 μM，根據(jù)試劑盒推薦），37°C 避光孵育 15–30 min。
3. 4°C PBS 洗 2 次（去除未結(jié)合 JC-1，避免背景），重懸于 PBS 或 Binding Buffer。
4. 流式上機(jī)：488 nm 激發(fā)，F(xiàn)L1 通道（綠色單體 ~530/30 nm），F(xiàn)L2/FL3 通道（紅色聚合物 ~585/42 或 610/20 nm）。也可熒光顯微鏡拍照。
5. 陽性對(duì)照：CCCP（10–50 μM）處理 15–30 min 誘導(dǎo)完全去極化；陰性對(duì)照：未處理健康細(xì)胞。
6. 數(shù)據(jù)分析：計(jì)算紅/綠 MFI 比值（或圈出“綠色高”亞群比例作為去極化細(xì)胞%）；建議用 FlowJo 做紅 vs. 綠雙參數(shù)圖。

方案3：Caspase 活性流式檢測

1. 推薦活細(xì)胞探針（如 Cell Meter?檢測試劑盒）：按試劑盒說明，1×10? cells/mL 加入 1–2× 工作濃度探針，37°C 避光孵育 1–4小時(shí)（期間可輕搖）。
2. 可選雙染：孵育結(jié)束后加DNA 染料（例如Green-DCS 用于死細(xì)胞）標(biāo)記細(xì)胞，繼續(xù)室溫 5–10 min。
3. 上機(jī)：FL3 通道（APC Caspase 活性 ~561 nm），F(xiàn)L1 通道（FITC通道 ~488 nm）。
4. 陽性對(duì)照：staurosporine（1 μM，4–6 h）或 camptothecin 處理；陰性對(duì)照：未處理細(xì)胞 + Z-VAD-FMK（廣譜 Caspase 抑制劑）預(yù)處理。
5. 數(shù)據(jù)分析：Caspase+ 細(xì)胞比例，或 Caspase MFI 比較。

方案4：TUNEL IF（免疫熒光檢測 DNA 斷裂）

1. 細(xì)胞接種于蓋玻片或腔室玻片，處理后用 4% 多聚甲醛（PFA）室溫固定 15–30 min。
2. PBS 洗 3 次，0.1–0.2% Triton X-100 通透 10 min（或用 0.1% 檸檬酸鈉 + 0.1% Triton 通透）。
3. PBS 洗 3 次，加 TdT 平衡緩沖液（Equilibration Buffer）室溫 10 min。
4. 配制 TUNEL 反應(yīng)液：TdT 酶 + 熒光 dUTP（如 FITC-dUTP 或 Alexa Fluor 488-dUTP），37°C 避光孵育 60 min（濕度盒內(nèi)）。
5. PBS 洗 3 次，DAPI 或 Hoechst 33342 復(fù)染核 5 min。
6. PBS 洗，抗熒光淬滅封片液封片，共聚焦或熒光顯微鏡觀察（488 nm 激發(fā)綠，405 nm 激發(fā)藍(lán)核）。
7. 陽性對(duì)照：DNase I 處理（產(chǎn)生人工斷裂末端）；陰性對(duì)照：不加 TdT 酶。
8. 解讀：凋亡細(xì)胞核呈明亮綠色點(diǎn)狀/彌散熒光（TUNEL+），常伴核濃縮/碎裂；統(tǒng)計(jì) TUNEL+ 細(xì)胞比例或每視野 TUNEL+ 核數(shù)。

方案5：PARP 裂解 Western Blot

1. 細(xì)胞處理后，冰上用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑 cocktail + 1 mM PMSF）裂解 30 min，每 10 min 渦旋一次。
2. 4°C 12,000 g 離心 15 min，取上清，BCA 法蛋白定量（建議 20–40 μg/泳道）。
3. SDS-PAGE（10% 分離膠），轉(zhuǎn) PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h。
4. 一抗：anti-PARP 抗體（1:1000，通常識(shí)別全長 116 kDa 和裂解 89 kDa 片段），4°C 過夜。
5. TBST 洗 3 次，二抗（HRP 標(biāo)記，1:5000）室溫 1 h，TBST 洗 3 次。
6. ECL 或超敏 ECL 顯影，ImageJ 定量裂解比例：裂解片段% = 89 kDa 灰度 / (116 kDa + 89 kDa) 灰度 × *。
7. 內(nèi)參：β-actin 或 GAPDH；陽性對(duì)照：staurosporine 處理組裂解片段明顯增加。

四、數(shù)據(jù)解讀與常見問題

• Annexin V/PI 四象限
  Q1 (Annexin- PI+) 壞死；Q2 (Annexin+ PI+) 晚凋亡；Q3 (Annexin+ PI-) 早期凋亡；Q4 活細(xì)胞。
• JC-1
  紅/綠比下降 >30% → 早期凋亡。
• Caspase-3
  活性升高 + Annexin V+ → 確認(rèn)凋亡通路。
• Sub-G1
  比例 >5-10% → 凋亡增加，但需結(jié)合其他標(biāo)志。
• 常見坑
  Annexin V 背景高 → 加 EDTA 對(duì)照；JC-1 毒性 → 濃度優(yōu)化；多參數(shù)補(bǔ)償串色 → 單染管校準(zhǔn)。

細(xì)胞凋亡檢測是多標(biāo)志物驗(yàn)證的過程，單一方法容易誤判。希望這篇全面指南幫你設(shè)計(jì)出可靠實(shí)驗(yàn)，有任何具體問題歡迎留言討論～

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